Descripción

Este esquema interactivo muestra como operar en un microscopio óptico el cambio de aumentos, el enfoque y la selección del contraste y sus resultados.

TÉCNICAS HISTOLÓGICAS

La Histología es una disciplina con más de 100 años de antigüedad, en este tiempo los histólogos han desarrollado gran cantidad de instrumentos, técnicas y procesos para poder visualizar las células y los tejidos. Describir todos estos instrumentos, técnicas y procesos sería motivo de una colección de libros completa.
El objetivo de este manual es introducir al estudiante en el conocimiento de las técnicas e instrumentos más habituales en un laboratorio de Histología, con el objetivo que el estudiante entienda cómo se han obtenido las muestras que luego estudiará al microscopio y así mejorar su proceso de aprendizaje.
Por esto centraremos el guión principal de este tema en las técnicas e instrumentos más habitualmente utilizados y en la parte final explicaremos otros tipos de instrumentos, técnicas y protocolos, que aunque se usan en Histología lo hacen de forma esporádica, para estudios determinados y específicos.

EL MICROSCOPIO
La Histología se centra en el estudio de células y tejidos. Dado el pequeño tamaño de estas estructuras, el histólogo requiere de sistemas de aumento de la imagen, lo que conocemos como microscopios, ya que a simple vista estas estructuras resultan tan pequeñas que no pueden ser claramente discernidas.
En la actualidad hay múltiples tipos de microscopios, aunque el microscopio óptico de campo claro es la herramienta básica de estudio y como tal el estudiante debe conocerlo suficientemente.

Para empezar, hay una serie de hechos que el estudiante debe conocer:
A.- El ojo humano es capaz de distinguir cosas pequeñas, pero como cualquier otro sistema óptico, tiene un límite; es decir, llega un momento que no es capaz de distinguir dos puntos como elementos separados sino como un sólo elemento. A esta separación mínima que permite reconocer dos puntos como separados se le conoce como "Límite de resolución". Esto ha hecho que el ser humano haya buscado sistemas para ampliar la imagen.
B.- El desarrollo de las primeras lentes en el siglo XVII provocó la aparición de los primeros y rudimentarios microscopios. Desde entonces, los microscopios han evolucionado hasta los actuales. A pesar de este desarrollo los microscopios ópticos tienen un límite de resolución que limita los aumentos y que viene determinado por la naturaleza propia de la luz.
C.- Hoy en día los mejores microscopios ópticos no sobrepasan los 1000 - 1500 aumentos y tienen un límite de resolución de 0,2 m (0,0002 mm).
D.- Se llaman microscopios simples a aquellos que tienen una, o un único conjunto de lentes. Es lo que coloquialmente se conoce como lupa.
E.- Se llaman microscopios compuestos a aquellos que tienen dos lentes o conjuntos de lentes, unas se conocen como lentes objetivos y las otras como lentes oculares. Los microscopios de laboratorio actuales son microscopios compuestos.
F.- En un microscopio compuesto es fundamental que la muestra a observar sea muy fina para que la luz pueda atravesarla y llegar a la lente objetivo.
G.- La luz atraviesa los diferentes tejidos de un corte de forma similar por lo que resulta casi imposible distinguir los diferentes componentes del corte. Es por eso que resulta necesario teñir los cortes para poder distinguir sus elementos componentes.

Además hay una serie de conceptos y definiciones relacionados con la microscopía que el estudiante también debe conocer para entender el microscopio y así manejarlo con más eficiencia.

CONCEPTOS Y DEFINICIONES:
- Aumento: Es el número de veces que un sistema de microscopio puede incrementar el tamaño de la imagen de un objeto.
- Poder de resolución: Es la capacidad de un sistema óptico de mostrar como elementos separados dos puntos muy cercanos entre sí.
- Límite de resolución: Es la distancia más pequeña a la que un microscopio puede mostrar dos puntos próximos como elementos separados y no como un único punto. Este parámetro depende de la longitud de onda de la luz (energía utilizada) y la apertura numérica del objetivo utilizado. En términos prácticos en un microscopio óptico convencional con un objetivo de 100x (y ocular y lentes intermedias de 15x, es decir a unos 1500 aumentos) es de 0,2 m. Se calcula mediante la fórmula: LR=/2AN (donde representa la longitud de onda y AN la apertura numérica).
- Apertura numérica: Es la capacidad del objetivo para dejar pasar la luz (mide el cono de luz que un objetivo puede admitir). Es única para cada objetivo.
- Profundidad de campo: Es la distancia entre las partes más separadas de un objeto (siguiendo el eje óptico del microscopio), que pueden verse sin necesidad de modificar el enfoque. Esta distancia es mayor en los objetivos de pequeño aumento y menor en los de mayor aumento.


El Microscopio óptico es un instrumento de precisión formado por multitud de piezas y partes, de las que es conveniente el estudiante conozca las más importantes. 1 Técnicas histológicas: Cómo es y cómo funciona el Microscopio Óptico

- Ocular: Es el conjunto de lentes que forma la imagen final ampliada que observamos.
- Revólver porta-objetivos: Los microscopios actuales suelen llevar varios objetivos que se disponen en una rueda llamada revólver. Para colocar el objetivo deseado hay que mover el revólver hasta la posición apropiada. Podemos encontrar microscopios dotados con revólver de 3, 4 o 5 posiciones.
- Objetivo: Es el dispositivo que contiene el conjunto de lentes que captan la luz proveniente de la muestra y generan la primera ampliación, los hay de diferentes aumentos.
- Platina porta-muestras: Es la superficie donde se coloca la muestra a observar.
- Sistema Köeller: Permiten centrar el haz de luz en el eje óptico del microscopio. (No todos los microscopios disponen de estos sistemas).
- Condensador: Permite concentrar el haz de luz en una zona pequeña de la muestra. (No visible en el esquema).
- Diafragma: Permite regular el contraste de la imagen.
- Control de intensidad de luz: Muchos microscopios actuales disponen de este dispositivo de control de la intensidad luminosa.
- Ruedas de desplazamiento: Son los mandos que permiten desplazar la muestra a lo largo y ancho de la platina porta-muestras (ejes X e Y).
- Control de enfoque micrométrico: Permite el foco fino mediante ligeros desplazamientos (en el eje Z) de la platina porta-muestras.
- Control de enfoque macrométrico: Permite la aproximación al plano focal mediante mayores desplazamientos de la platina porta-muestras a lo largo del eje Z (vertical).
- Estativo: Es la carcasa metálica que sirve de soporte a todo el resto del sistema. El estativo se acopla a la base formando un bloque sólido y estable.

Diferentes conjuntos de lentes y otros elementos ópticos definen la trayectoria de la luz en el microscopio.
1.- La luz necesaria para el funcionamiento del microscopio es generada por una bombilla.
2.- El diámetro del haz se restringe mediante el uso de una apertura (una placa metálica con un agujero.
3.- Las lentes condensadoras condensan el haz sobre la muestra.
4.- El objetivo realiza una primera ampliación de la imagen. La ampliación depende del objetivo elegido.
5.- Un prisma cambia la dirección de la luz para realizar una observación cómoda en un ángulo correcto.
6.- El ocular realiza la segunda y definitiva ampliación de la imagen.

Como se puede observar en el esquema los elementos ópticos presentes en un microscopio son numerosos y variados y los podemos dividir en dos categorías: aquellos destinados a generar, modular, concentrar y condensar la luz (como diafragmas, condensadores, aperturas, etc...) y aquellos otros destinados a ampliar la imagen (objetivos y oculares).
Sin duda los más importantes son objetivos y oculares.
- Objetivos: El microscopio suele disponer de tantos objetivos diferentes como posiciones tiene el revólver, los más habituales son los revólveres de 4 posiciones. La variedad de objetivos en el mercado es grande, aunque los 4 objetivos más habituales en los microscopios de laboratorio suelen ser 4x, 10x, 40x y 100x, siendo este último de inmersión.
- Oculares: Todo microscopio de laboratorio convencional dispone de 1 (si es monocular) o de dos oculares iguales (si es binocular). Los oculares más habituales con de 10 aumentos (10x) aunque algunos fabricantes ofertan, para trabajos especiales, otros oculares (5x ó 15x, por ejemplo).

Teniendo en cuenta que los aumentos totales de un microscopio es el resultado de la multiplicación de los aumentos parciales de objetivo y ocular podemos deducir que el rango de aumentos de un microscopio óptico convencional va de 40x a 1.000x.
En los microscopios binoculares un o los dos oculares pueden graduarse, lo que permite una correcta visión binocular incluso si se usa gafas, cuya corrección óptica puede compensarse graduando los oculares. En un microscopio monocular no es necesario ni esto.
EN LA MAYORÍA DE CASOS NO ES NECESARIO USAR LAS GAFAS CON EL MCIROSCOPIO.

El estudiante debe aprender a operar el microscopio correctamente. 2 Técnicas histológicas: Operativa del microscopio óptico
El primer paso es comprobar que el microscopio está correctamente conectado y la luz funciona con la intensidad adecuada.
En primer lugar, recordar al estudiante que use gafas que debe ajustar los oculares.
Aunque parezca obvio hay que colocar la preparación correctamente, es decir con el cubreobjetos hacia arriba.
El estudio de cualquier preparación debe empezar con el objetivo más pequeño (en muchos microscopios el objetivo 4 X). Lo más habitual es estudiar toda la superficie de la muestra para localizar las diferentes estructuras.
Una vez localizada la estructura que se desea estudiar cambiar al siguiente objetivo (10x) y realizar la misma operación, hasta llegar, si es preciso, al objetivo de mayor aumento (100x).
Sin duda el estudiante conocerá el concepto de "Difracción de la luz", el cual se puede resumir diciendo que la luz cambia ligeramente de dirección cuando pasa de un medio a otro (por ejemplo del vidrio al aire). El cambio de dirección se da según un ángulo que depende de cada uno de los medios y que puede expresarse por un valor único para cada medio que se conoce como "índice de refracción".
Usando objetivos de poco aumento este fenómeno apenas afecta a la observación, pero sí que se convierte un inconveniente cuando usamos un objetivo de 100x, fundamentalmente debido a que a estos aumentos la preparación debe estar muy cerca del objetivo y el cambio de dirección de la luz desde el vidrio (portaobjetos) al aire y otra vez al vidrio (lente) provoca que no pueda enfocarse correctamente la muestra. para evitar esto se debe colocar, entre la lente del objetivo y la parte superior de la muestra una pequeña gota de un aceite especial (aceite de inmersión), el cual tiene un índice de refracción similar al del vidrio, por lo que la luz no cambian de dirección en esta interface y consecuentemente se puede enfocar sin problemas.
Si después de estudiar la muestra con el objetivo 100x fuera necesario volver a estudiarla con el objetivo 40x es necesario recordar que la muestra aún tiene una gota de aceite de inmersión que ensuciará este objetivo, por lo que será necesario limpiarla con un pañuelo o trozo de papel suave empapado en solución limpiadora.
Una vez acabada la observación se debe retirar la preparación limpiarla, como se acaba de describir, al igual que el objetivo de 100x.
Al terminar el período de observación se debe comprobar que tanto el microscopio (platina, objetivos), así como las preparaciones estén totalmente limpios.
También comprobaremos que el microscopio esté correctamente desconectado y nos aseguraremos de dejar colocado el objetivo más pequeño, para facilitar el siguiente uso del microscopio.

PREPARACIÓN DE MUESTRAS
Ahora que conocemos que el microscopio óptico obtiene una imagen ampliada al atravesar la luz una muestra y un conjunto de lentes, resulta evidente que no podemos estudiar un órgano o un trozo de un órgano al microscopio, ya que la luz no la podría atravesar. Se hace necesario obtener muestras finas que la luz pueda atravesar y se puedan estudiar al microscopio.
¿Cómo hacer para obtener muestras finas?
La respuesta es obvia, hay que realizar cortes finos del órgano a estudiar, lo cual no resulta fácil, esto lo podrá comprobar el estudiante si intenta cortar con un cuchillo muy afilado un trozo de carne fresca, comprobará que no puede obtener láminas finas. Esto es debido a que la carne fresca no tiene ni la consistencia ni la dureza necesaria para poder obtener cortes lo suficientemente finos, mientras que si congelamos la carne o la dejamos secar, si que resulta posible cortar la carne, ya que esta, en ambos procesos, ha aumentado su dureza y consistencia..
Como los órganos a estudiar tienen una consistencia similar al trozo de carne fresca del ejemplo se hace necesario incrementar la dureza y consistencia de forma artificial, para ello existen diferentes métodos, siendo el método más empleado la inclusión en parafina. No es un proceso simple y consta de numerosos pasos. 3 Técnicas histológicas: Cómo se hace para obtener cortes histológicos, la inclusión y el corte

1.- FIJACIÓN
El material biológico, a partir del momento de la muerte, sufre un proceso de degradación, conocido como putrefacción, debido tanto a causas endógenas (autolisis) o exógenas (ataques bacterianos). Resulta evidente que esta degradación dificulta progresivamente (a más tiempo más degradación) el estudio de las estructuras biológicas al microscopio.
Para evitar esta degradación se hace necesario estabilizar las estructuras y hacerlas inasequibles a tal degradación, para ello se utilizan sustancias químicas conocidas como "fijadores". La naturaleza química de los fijadores es variada aunque suelen ser moléculas con varios grupos activos que se unen a diferentes moléculas de la célula generando una red molecular interconectada que hace los ataques bacterianos y enzimáticos sean infructuosos, manteniendo de esta manera la estructura celular.
Para las técnicas de microscopía óptica convencional se suelen utilizar fijadores basados en el formaldehido, bien sea en soluciones tamponadas o mezclado con otras especies químicas (como con el ácido pícrico en el caso del fijador de Bouin).
La forma de administrar el fijador a la muestra depende mucho de las circunstancias de obtención.
- Así, en muestras humanas (y animales) obtenidas post-mortem (necropsias) u obtenidas por extracción directa (biopsias), el método de fijación es sencillo: se sumerge la muestra en un recipiente lleno de la sustancia fijadora. El fijador debe difundir por los tejidos para realizar su acción. A veces, y dependiendo de la naturaleza de los tejidos esta penetración no es completa y se observa un gradiente de fijación, estando mejor fijadas las zonas periféricas y con peor fijación, las zonas centrales.
- En el caso de animales de experimentación y para evitar el efecto de gradiente de fijación se suele utilizar el método de la perfusión. La idea es sencilla: se trata de inyectar el líquido fijador en el sistema cardiovascular para que este lo distribuya por todo el organismo y así la fijación sea homogénea en todos los tejidos. Normalmente se suele inyectar el líquido fijador a la altura del ventrículo cardíaco o arteria aorta y se debe drenar la sangre a la altura de la aurícula para evitar una sobrepresión del sistema que produzca rotura de capilares sanguíneos.
Sea en un caso o en el otro se deja la pieza un tiempo para que el líquido fijador concluya su efecto. En este punto la pieza se introduce en un casete porta-muestras (una pequeña caja de plástico agujereada). Este porta-muestras permite el fácil cambio de las muestras de unos recipientes a otros manteniendo la integridad de la pieza. Pasado el tiempo de fijación la pieza debe limpiarse con frecuentes baños de agua, primero agua corriente y posteriormente agua destilada, para eliminar los restos de fijador que pudieran reaccionar con las sustancias químicas que deberán ser usadas posteriormente.

2.- INCLUSIÓN
La inclusión es el proceso por el cual se incrementará la dureza y consistencia de la pieza para permitir su corte. Esto se consigue incluyendo la pieza en una sustancia que tenga la dureza y consistencia adecuada. La sustancia habitualmente utilizada en este proceso es la parafina. El reto consiste en sustituir el agua que hay en el interior y exterior de las células por parafina.
La parafina es una sustancia que por encima de los 600C es líquida y solidifica por debajo de esta temperatura, esto facilita de difusión de la parafina por los tejidos cuando está líquida, no obstante otro problema que hay que salvar es el hecho que la parafina es altamente hidrófoba, es decir no se puede mezclar con el agua o sustancias en medio acuoso. Por ello el siguiente paso que debe sufrir las muestras es la eliminación del agua de la muestra: la deshidratación.
La deshidratación de las muestras se consigue mediante una sustitución progresiva del agua por etanol. Para conseguirlo se somete a las piezas a sucesivos baños de etanol de gradación creciente, empezando por etanol 500 ó 700 y concluyendo con diferentes baños de etanol absoluto (1000), pasando por baños de etanol 960.
La pieza, ya deshidratada, aún no puede ser pasada a parafina ya que el etanol no es miscible con la parafina. Se usa un agente intermediario, es decir una sustancia que sea miscible tanto con el etanol como con la parafina. El intermediario habitualmente usado es el Xileno, en el que la pieza sufre varios baños para sustituir totalmente al etanol.
Con la pieza en Xileno, se suele pasar por un baño de una mezcla de Xileno-Parafina al 50% para favorecer la penetración de la parafina. Posterior a este baño se suceden varios baños en parafina pura hasta conseguir que la parafina haya penetrado completamente en toda la pieza. Todos estos baños que incorporan parafina se realizan en estufa 600C para mantener la parafina líquida. En algunos laboratorios todo este proceso se realiza de forma automatizada usando un dispositivo (robot), que va cambiando las muestras de un líquido a otro mediante un programa preestablecido.
Una vez pasado el tiempo necesario para que la parafina penetre en los tejidos, la cuestión es realizar un bloque con todo ello, que pueda ser usado en el microtomo para obtener cortes. 4 Técnicas Histológicas: Realización de bloques en parafina
La forma más sencilla es usar un molde en el que se vierte la parafina y en el que se introduce la muestra procesada y se deja enfriar para que el conjunto se solidifique. En muchos laboratorios se utiliza una estación a tal efecto. Estas estaciones disponen de depósito de parafina líquida (600C), desde el que se puede dispensar parafina sobre el molde mediante un grifo; dispone también de una cámara donde se guardan los diferentes moldes a 600C y una placa caliente (600C) y otra fría (40C). La dinámica es sencilla, se coloca el molde debajo del grifo dispensador de parafina y se llena con parafina líquida, se coloca la pieza y se orienta, colocando, por último la base del casete de inclusión. Se desplaza con cuidado el conjunto encima de la placa fría para conseguir una solidificación rápida que no forme cristales y una vez solidificado se extrae el molde obteniendo un bloque listo para cortar, tal y como se ve en el esquema interactivo.

3.- CORTE (EL MICROTOMO)
El microtomo (del griego, micros "pequeño" y tomos "sección/parte") es el instrumento adecuado para obtener cortes finos de material biológico incluido en parafina.
En esencia, el microtomo consta de una cuchilla fija y de un brazo móvil, el cual adelanta y sube y baja la muestra, para que esta incida sobre la cuchilla y así obtener los cortes. A este tipo de microtomos se les denomina "microtomo rotatorio o de Minot". 5 Técnicas histológicas Cómo es y cómo funciona el Microtomo
El brazo es capaz de adelantar la muestra distancias muy pequeñas (habitualmente de 5 a 10 m) gracias a un sistema mecánico de precisión basado en un tornillo sin fin de paso de rosca muy fino.
En el extremo del brazo hay unja pinza en la que encajan las bases de casete utilizadas para formar el bloque. El brazo avanza con el bloque en posición elevada, cuando ha avanzado la cantidad de micras deseada el brazo baja el bloque incide sobre el filo de la cuchilla y el corte se deposita sobre ella, cuando el brazo llega a su posición inferior, vuelve a subir e inicia un nuevo ciclo de corte. El proceso se controla mediante una manivela circular, que al ser accionada concluye un ciclo de corte por cada vuelta.
Las cuchillas de microtomía están muy afiladas para conseguir cortes finos y homogéneos, en la mayoría de laboratorios se suelen utilizar cuchillas intercambiables, que son sustituidas cuando pierden filo.
Al incidir el bloque en el filo de la cuchilla, por el rozamiento, se incrementa la temperatura lo suficiente para que el borde del nuevo corte su funda ligeramente y se una con el corte previo, así, al realizar varios cortes, estos forman una tira sobre la superficie de la cuchilla.

4.- MONTAJE DE CORTES
Para poder observar los cortes al microscopio es necesario montarlos sobre una fina lámina de vidrio (portaobjetos). 6 Técnicas histológicas: Manejo de los cortes histológicos
Para ello, en primer lugar se separan los cortes uno a uno o en pequeñas tiras que puedan ser montadas sobre el portaobjetos.
Los cortes salen arrugados del microtomo debido a la fricción entre la cuchilla y el bloque, por lo que se hace necesario estirar los cortes para su correcta observación.
Para conseguirlo los cortes se hacen flotar en un baño de agua templada (sobre los 35-360C). Por efecto del calor, la parafina se dilata estirando el corte hasta dejarlo completamente liso. Cuando los cortes estás estirados, sencillamente se pescan con el portaobjetos. Previamente sobre la superficie del portaobjetos se extiende una fina capa de una sustancia adherente que fija el corte al portaobjetos y evita que el corte se desprenda en los procesos posteriores. En muchos laboratorios se usa la Poli-L-Lisina como sustancia adherente.
Cuando tenemos los cortes situados sobre el portaobjetos se dejan secar (habitualmente en una estufa a 35-360C).

5.- TINCIÓN
El material biológico cortado fino es, básicamente, transparente, por lo que no se puede distinguir nada al observarlos al microscopio.
Es por esto que se hace necesario teñir las muestras para poder distinguir las células y los tejidos.
Los protocolos de tinción se realizan mediantes baños secuenciales de distintos colorantes y reactivos. Hay diferentes formas de hacer esto:
- Se pueden poner los portaobjetos sobre una rejilla dispuesta en una bandeja y mediante una pipeta se van colocando los diferentes colorantes y reactivos.
- Se pueden teñir varios portaobjetos colocados en cestillas especiales de vidrio las cuales se van pasando de una cubeta a otra, conteniendo cada cubeta el colorante o reactivo pertinente.
- Este mismo proceso de tinción en cestillos se puede realizar de forma automatizada mediante un robot que va cambiando automáticamente el cestillo de cubeta mediante un programa de tiempos predeterminado.
Sea cual sea el método empleado, el protocolo (secuencia de pasos) de tinción a emplear dependerá de aquello que se quiera mostrar de los tejidos procesados.
De protocolos (técnicas) de tinción se han escrito numerosos libros ya que son muy numerosos y variados. Al final de este tema haremos una reseña de las técnicas más habituales utilizadas en Histología.
Entre todas las técnicas de tinción hay una que destaca sobre las demás ya que es con mucha diferencia, la más utilizada en todo el mundo, se trata de la técnica de la Hematoxilina-Eosina. 7 Tejido epitelial simple columnar
La hematoxilina es una mezcla colorante (existen diferentes variantes) que tiene un carácter básico por lo que se une a sustancias ácidas. En las células, la zona más ácida es el núcleo ya que está repleto de ácidos nucléicos (ADN), por lo qué el núcleo se teñirá con la hematoxilina de un color azul-violáceo.
La eosina es un colorante de tonalidad rosa-rojo que se disuelve en etanol y tiene un carácter ácido, por lo que se une a las estructuras básicas (pH alto) de los tejidos. Las estructuras con mayor pH de los tejido son las proteínas, debido a los puentes de Azufre y Nitrógeno que tienen. Es por eso que en muestras procesadas con esta técnica, se tiñen de color rosa, preferentemente, el citoplasma y la matriz extracelular, ambas estructuras ricas en proteínas.
Todo proceso de tinción se puede dividir en tres fases:
- La primera fase consiste en el desparafinado e hidratación de los cortes. Para desparafinar se bañan los cortes con Xileno, el cual disuelve la parafina y la hidratación se realiza con una secuencia de pasos inversa a la de la deshidratación.
- Con la muestra en un medio acuoso se procede con el protocolo de tinción elegido. El protocolo suele constar de una secuencia de baños con los colorantes, limpiadores y reactivos, que es propio de cada técnica.
- La tercera fase tiene como objeto el montaje permanente de las muestras para su observación al microscopio. Para montar y proteger los cortes se coloca encima de ellos un medio de montaje: una sustancia líquida que con el aire cristaliza (polimeriza) y una lámina muy fina de vidrio (cubreobjetos), que forman un conjunto estable y duradero. El medio de montaje suele ser una sustancia hidrófoba, por lo que los cortes antes de ser montados han de ser deshidratados, siguiendo un protocolo similar al utilizado durante la inclusión.
La preparación montada se deja secar unas horas y se guarda en oscuridad para evitar que la luz degrade los colores.

ESTUDIO DE LAS MUESTRAS AL MICROSCOPIO
Con todo lo explicado hasta ahora el estudiante se puede hacer una clara idea del proceso que se realiza hasta obtener las preparaciones que estudiará al microscopio.
Ahora, sería conveniente que el estudiante tuviese en cuenta algunos conceptos necesarios para el estudio de las muestras al microscopio. 8 Técnicas histológicas: Planos y profundidad del corte histológico
- En primer lugar, el estudiante ha de entender que las estructuras biológicas son estructuras tridimensionales, y habitualmente complejas, de las cuales, al microscopio, solamente se pueden ver secciones planas (en dos dimensiones). Así, por ejemplo, los túbulos renales son tubos cilíndricos, con lo que cabria esperar que al microscopio estos túbulos se vieran como anillos (la sección de un cilindro). La cuestión es que estos tubos no son rectilíneos y presentan muchos giros (como otros tubos del organismo, p.ej. el intestino), así que en un mismo corte y de un mismo túbulo se pueden ver numerosas secciones tal y como muestra el esquema. Es decir el estudiante deberá tener en cuenta que una misma estructura cortada en diferente orientación puede mostrar secciones diferentes.
- Abundando en este mismo tema de la tridimensionalidad, otro hecho que hay que tener en cuenta es la profundidad del corte. Este problema se ilustra perfectamente en el esquema adjunto donde se toma como ejemplo un huevo (que en esencia es una célula). Este huevo aún cortado en el mismo plano puede mostrar secciones diferentes dependiendo de la profundidad a la que se haya hecho el corte.
Es importante que el estudiante entienda ambos conceptos para poder interpretar correctamente las estructuras que observará al microscopio.
Por otra parte el estudiante debe adoptar una dinámica correcta de observación de muestras para el máximo aprovechamiento de cada sesión de estudio.
Nuestro consejo es:
- Empezar por observar la preparación a simple vista colocándola sobre una superficie blanca. En muchos casos el estudiante podrá localizar los elementos anatómicos más destacados del órgano a estudiar.
- En segundo lugar, colocar la preparación en la platina y observarla con el objetivo más pequeño (4x) y navegar por toda la preparación localizando las áreas de interés y elementos singulares.
- Por último, y con las áreas de interés localizadas, ir utilizando progresivamente los objetivos de mayor aumento, en cada una de estas áreas, hasta distinguir los elementos estructurales, tejidos y tipos celulares propios de la muestra estudiada.

Hasta ahora hemos descrito los procedimientos, instrumentos y procesos de tinción más usuales en el estudio convencional de la anatomía, ahora daremos un breve repaso a otros tipos de instrumentos, procesos de inclusión y protocolos de tinción, que también se suelen utilizar en Histología.

OTROS TIPOS DE MICROSCOPIO
Aparte del microscopio óptico de campo claro, que es el más utilizado en cualquier laboratorio de Histología, existen otros tipos de microscopios cuyos resultados (imágenes) el estudiante probablemente usará durante su aprendizaje, aunque es poco probable que los use directamente ya que suelen ser escasos, complejos de uso y caros. 9 Técnicas histológicas: Ejemplos de resultados de diferentes tipos de microscopios

MICROSCOPIO ELECTRÓNICO DE TRANSMISIÓN (MET)
El microscopio electrónico de transmisión es un instrumento de estudio que utiliza la misma estructura conceptual que un microscopio óptico convencional, pero que usa un haz de electrones en lugar de un haz de fotones (haz de luz). 10 Técnicas histológicas: Cómo es y cómo funciona el MET (Microscopio Electrónico de Transmisión)
La longitud de onda del electrón es menor de 1nm, es decir aproximadamente unas 500 veces más pequeña que la longitud de onda de la luz (aprox. 400-600 nm), por lo que con un microscopio electrónico de transmisión se pueden conseguir aproximadamente 500.000 de aumentos.
El hecho de utilizar electrones en un microscopio comporta una serie de problemas:

- Primero, hay que tener en cuenta que los electrones están cargados eléctricamente por lo que si estos electrones, en su trayectoria, se encuentran con átomos, por electrostática, las nubes de electrones de esos átomos desviarán a los electrones del haz, haciendo imposible la obtención de una imagen coherente. Por esto en el interior de los microscopios electrónicos debe hacerse el más completo vacío.
- En segundo lugar, hemos de tener en cuenta que para que un microscopio se comporte como tal, es necesario disponer de unas lentes, que modifiquen la trayectoria del haz. El problema es que las lentes ópticas no sirven para este propósito, así que hay que dotar al microscopio electrónico de otro tipo de lentes. La forma de modificar un haz de electrones es mediante el uso de un campo magnético, es por esto que las lentes de un microscopio electrónico son bobinas electromagnéticas que generan esos campos magnéticos.
- En tercer lugar está el grosor del corte. Si utilizamos un corte de los utilizados para microscopia óptica (de 5 a 10 m de grosor), la cantidad de material biológico comprendida en este grosor es tal que la imagen sería incomprensible. Es por esto que el grosor de los cortes para este tipo de microscopía han de ser mucho más finos, oscilan entre los 40 y 50 nm. (0.04-0.05 m). Además tampoco se pueden utilizar portaobjetos de vidrio (por muy finos que sean) ya que el haz de electrones no lo atravesaría, es por esto que se suele utilizar como portaobjetos una fina rejilla metálica (cobre), el corte reposa sobre los filamentos de la rejilla quedando suspendido en los espacios entre filamentos.
- Luego debemos resolver el problema del contraste (tinción). Las muestras biológicas presentan un contraste frente a los electrones muy similar entre si y en general muy bajo, por lo que se hace necesario incrementarlo. En microscopia electrónica no sirven los colorantes usados en microscopia óptica (apenas ofrecen contraste frente a los electrones), por lo que es necesario usar otro tipo de sustancias contrastadoras. Se usa básicamente, Acetato de uranio, esta molécula se une químicamente al material biológico y con la gran cantidad de electrones del átomo de Uranio, hace que allí donde haya una acumulación de material biológico (con acetato de uranio adherido químicamente) los electrones no atraviesan la muestra, al ser desviados por la nube electrónica, mientras que allí donde haya una baja concentración de material biológico, los electrones atravesarán la muestra más fácilmente. Esto provoca que la imagen final se componga mediante la presencia o ausencia de electrones. LAS IMÁGENES DE LOS MICROSCOPIOS ELECTRÓNICOS SON SIEMPRE MONOCROMÁTICAS (BLANCO Y NEGRO).
- El último problema que se ha de solucionar es la obtención de la imagen. El ojo humano no es capaz de ver electrones, por lo que es necesario idear un sistema para obtener una imagen visible. El sistema utilizado es una placa de fósforo. El fósforo tiene la propiedad que al ser alcanzado por un electrón libera un fotón, así se consigue la imagen. Aparte, los electrones también pueden impresionar una placa fotográfica convencional, e incluso con la ayuda de un captador digital de electrones, se puede obtener una imagen en un monitor de ordenador.

Procesamiento de muestras para el MET
En esencia el procesamiento de las muestras para el MET es similar al usado en microscopía óptica convencional, teniendo en cuenta las peculiares propias del MET.
- En primer lugar hay que tener en cuenta que al observar a más aumentos se hace necesario que la conservación de las estructuras biológicas sea mucho más fiel y precisa que para la microscopía óptica. Es por ello que se suelen usar fijadores mucho más potentes, tales como el Glutardialdehido, e incluso se suele hacer una postfijación con Tetraóxido de Osmio (OSO4), que tiene cuatro grupos activos, que forman redes mucho más tupidas del material biológico de la muestra.
- Luego hay que tener en cuenta, que como hemos dicho el corte ha de ser mucho más fino (40 - 50 nm = 0,04 - 0,05 m), se les denomina cortes ultrafinos. Para ello resulta obvio que necesitaremos un microtomo de mayor precisión (ultramicrotomo). Además las piezas deberán incluirse en un material más duro que la parafina para obtener cortes de tal grosor. El material más utilizado son las resinas sintéticas poli-componente, que requieren de un procesamiento similar al de la parafina, con la diferencia que estas resinas son líquidas a temperatura ambiente y que polimerizan a ciertas temperaturas.
- El ultramicrotomo funciona en esencia como el microtomo rotatorio de Minot con la peculiaridad de que su mecánica es mucho más precisa, lo cual permite los desplazamientos tan pequeños que se requieren para obtener cortes ultrafinos. Otra peculiaridad de este tipo de microtomía radica en la naturaleza de las cuchillas, las cuales han de ser de un material extremadamente duro para poder cortar los bloques de resina. Habitualmente estas cuchillas son de un vidrio especialmente tratado que permite la obtención de una serie de 30 o 40 cortes, después de los cuales la cuchilla ha de ser reemplazada ya que ha perdido el filo. En ocasiones determinadas se pueden emplear cuchillas con filo de diamante, que como el estudiante entenderá son poco habituales dado su elevado precio. Se adosa a la cuchilla una pieza de plástico al efecto, la cual forma una cavidad la cual se llena de agua donde flotan los cortes, una vez realizados, y donde son capturados con las rejillas porta-muestras.
- Las rejillas con los cortes adheridos se pasan por los reactivos necesarios para realizar el contraste (acetato de uranio y otros), luego se dejan secar y ya se pueden observar al MET. A diferencia del procesamiento con parafina, en esta técnica no se elimina el medio de montaje (resina).

Con el ultramicrotomo también se pueden obtener cortes más gruesos (1 - 2 mm) para su estudio en microscopía óptica convencional (de campo claro), a estos cortes se les conoce como "semifinos".

MICROSCOPIO ELECTRÓNICO DE BARRIDO (MEB / SCANNING)
El microscopio electrónico de barrido (scanning), utiliza, también, un haz de electrones y utiliza bobinas electro-magnéticas como lentes, pero ahí acaban las similitudes. 11 Técnicas histológicas. Como es y como funciona el MEB (Microscopio Electrónico de Barrido / Scanning)
Este microscopio se utiliza para el estudio de superficies, no para el estudio de los componentes íntimos de tejidos y células.
Para ello el haz de electrones no atraviesa la muestra, sino que unas bobinas deflectoras realizan un barrido de la superficie de la muestra.

Procesamiento de muestras para el MEB
La muestra, para este tipo de microscopia, no es un corte fino sino que se trata de una muestra completa (o casi completa), así con esta técnica se pueden estudiar pequeños organismos enteros, como por ejemplo, los insectos.
La preparación de la muestra también es diferente a la que se realiza para el M.E.T. Para el M.E.B. no se realizan cortes sino que la pieza, (una porción de tejido, un insecto, etc...) Se deshidrata y se recubre con una capa fina (mono-molecular) de un metal conductor (habitualmente oro).

Al bombardear la muestra con un haz de electrones (electrones primarios) la capa metálica reacciona emitiendo un electrón por cada electrón que recibe. Estos electrones emitidos (que se llaman electrones secundarios) tienen la característica que se emiten en un ángulo que depende del ángulo de incidencia de los electrones primarios con respecto a la superficie de la muestra.
Los electrones secundarios son recogidos por un captador de electrones dividido en una matriz de celdillas, luego un sistema informático se encarga de generar una imagen en un monitor, en la base de: un punto de luz por cada electrón detectado.
Como los electrones secundarios indicen en la matriz en diferente número en cada celdilla, debido al ángulo en el que son generados, la imagen muestra claros y oscuros, que reflejan la superficie tridimensional de la muestra, dando una información adicional de los tejidos a aquellas que se puede obtener con un Microscopio óptico convencional o incluso con un MET.

OTROS MICROSCOPIOS ÓPTICOS
En este apartado vamos a hacer una breve reseña de otros microscopios ópticos (que usan luz), que se utilizan en el estudio histológico, aunque en ciertas circunstancias.

Microscopio de contraste de fases:
Este tipo de microscopio se basa en la propiedad óptica del cambio de fase de un haz de luz al atravesar un objeto compuesto de materiales de diferente índice de refracción. Mediante esta técnica se pueden observar materiales sin teñir y resulta especialmente útil para el estudio de material vivo (cultivos celulares, etc...)

Dispositivo de campo oscuro:
Este dispositivo hace que la luz no incida perpendicularmente a la muestra, sino tangencialmente, por lo que es refractada por la muestra hacia el objetivo, en las zonas en las que no hay material se ve todo negro, de ahí el nombre de “campo oscuro”.

Microscopio de fluorescencia:
Este microscopio utiliza luz ultravioleta en lugar de luz blanca. Esta luz provoca fluorescencia en ciertas sustancias (fluoro-cromos) que son las que se utilizan como colorantes. En este tipo de microscopio el fondo queda negro y las estructuras marcadas con el fluoro-cromo emiten su propia luz (que es la que se ve).

Microscopio confocal:
El microscopio confocal es un microscopio óptico de características especiales y reciente aparición.
Las prestaciones de este microscopio son singulares, así por ejemplo, se pueden observar muestras gruesas, de las que el microscopio obtiene imágenes no de todo el grosor de la muestra, sino de secciones de pequeño grosor (al estilo de la tomografía axial computerizada) que luego, mediante programas informáticos, puede reconstruir en una estructura tridimensional que se muestra en una pantalla de ordenador.
También permite el estudio de muestras vivas (cultivos celulares) a lo largo del tiempo, lo cual lo hace idóneo para la comprensión de ciertos procesos biológicos.
Es un microscopio de reciente aparición, no por la complejidad óptica de sus construcción, que ya estaba en funcionamiento en los años cincuenta, sino por la complejidad del hardware y software informático necesario.
El microscopio confocal dispone de varios emisores láser, que son las fuentes de luz utilizadas.
Cada uno de esos los láseres es de longitud de onda diferente e incide sobre la muestra donde excita a los foto-cromos (que son los “colorantes”) que responden, cada uno a una longitud de onda determinada, permitiendo la realización de marcajes múltiples en una misma muestra, revelando distintas estructuras en diferentes colores.

OTRAS TÉCNICAS DE TINCIÓN
En el apartado "TINCIÓN" se ha comentado la técnica de la Hematoxilina-Eosina, que es, sin duda, la técnica más utilizada en Histología, pero obviamente hay muchas más técnicas de tinción. En este apartado haremos la reseña de otras técnicas, entre muchas, que también se utilizan en Histología, aunque con mucha menos frecuencia que la H-E y siempre para mostrar características específicas de tejidos y/o tipos celulares. 12 Técnicas histológicas: Ejemplos de técnicas de tinción

TÉCNICAS QUÍMICAS GENERALISTAS (CONVENCIONALES)
Estas técnicas tienen como objetivo mostrar las características generales, especialmente la topografía, de tejidos y órganos. La base de estas técnicas es una reacción química (ácido-base, oxidación-reducción) entre los colorantes y los elementos estructurales de los tejidos.
Estas técnicas son muchas y muy variadas, que pueden ser clasificadas atendiendo al número de colorantes, en: monocrómicas, bicrómicas y tricrómicas.
En este apartado deberíamos incluir la técnica de la Hematoxilina-Eosina (bicrómica), explicada anteriormente.

Técnicas monocrómicas
Estas técnicas utilizan un sólo colorante que tiñe todos los tejidos de forma semejante y la diferenciación se consigue gracias a la diferente naturaleza de los tejidos, así un epitelio formado por una lámina continua de células se tiñe más intensamente que el tejido conectivo donde conviven fibras (que se tiñen menos) con algunas células.
Entre estas técnicas cabe mencionar:
- Azul de Anilina
- Azul de Toluidina
- Hematoxilina de Hedienhain
- Rojo neutro
Estas técnicas se suelen realizar sobre cortes en parafina de entre 5 y 10 m.

Técnicas tricrómicas
Como su nombre indica, estas técnicas utilizan una combinación de tres colorantes. Una característica propia de estas técnicas es que suelen teñir el tejido conectivo de forma diferencial, ya que uno de los colorantes suele tener afinidad por las fibras (colágenas) de la matriz extracelular de este tejido.
Estas técnicas se suelen utilizar, al igual que la hematoxilina-eosina, para el estudio topográfico de órganos, con el valor añadido de la facilidad de reconocimiento del tejido conectivo.
Las técnicas tricrómicas más usadas son:
- Tricrómico de Masson
- Tricrómico de Mallory
Estas técnicas se suelen realizar sobre cortes en parafina de entre 5 y 10 m.

TÉCNICAS QUÍMICAS ESPECÍFICAS
Se engloban en este apartado aquellas técnicas que se basan en una reacción química convencional entre algún colorante y un elemento específico propio de tipos celulares, fibras extracelulares, etc...
A continuación se exponen unas pocas de estas técnicas que suelen usarse en los laboratorios de Histología.

Técnica de PAS-H
Esta técnica se basa en el uso combinado del Ácido Peryódico junto con el reactivo de Schiff.
Esta combinación tiñe de forma selectiva mucopolisacáridos. Estos componentes se encuentran en las láminas basales de epitelios, secreciones mucosas o el glicocálix de microvellosidades, por lo que estos elementos se tiñen selectivamente de color rosa-rojo.
Se suele combinar con la hematoxilina, la cual tiñe los núcleos de color azul-violeta y permite localizar mejor los elementos teñidos con el PAS.
Esta técnica se suele realizar sobre cortes en parafina de entre 5 y 10 m.

Técnica de PAS - Azul Alcián
Esta técnica combina la reacción del PAS con el azul alcián. El azul alcián tiñe específicamente los mucopolisacáridos de carácter ácido en contraposición del PAS que tiñe mucopolisacáridos de carácter neutro.
Por esto esta técnica se usa preferentemente en el estudio de las secreciones mucosas del tracto digestivo diferenciando secreciones mucosas neutras (rosa-rojo) de las secreciones mucosas ácidas (azul).
Esta técnica se suele realizar sobre cortes en parafina de entre 5 y 10 m.

Técnica de la Orceína Picro-Índigo-Carmín
Esta técnica está especialmente recomendada para el estudio del sistema cardiovascular, ya que tiñe de color rojo-marrón las fibras elásticas (por ejemplo las de las arterias elásticas o las del endocardio auricular), mientras que tiñe de azul-verdoso pálido las fibras colágenas (por ejemplo las de la adventicia arterial o venosa o las del epicardio cardíaco).
Estas técnica se suele realizar sobre cortes en parafina de entre 5 y 10 m.

Técnica de Gordon-Sweets
Está técnica está basada en el uso de sales de plata, las que en combinación con los otros reactivos usados en esta técnica, tiñe selectivamente de negro las fibras reticulares del tejido conectivo.
Esta técnica se suele realizar sobre cortes en parafina de entre 5 y 10 m.

Técnica del Sudán IV
El Sudán IV es un colorante liposoluble, por lo que resulta muy adecuado para teñir elementos grasos, tales como los adipocitos.
Para poder realizar esta técnica, durante el procesamiento de los tejidos no se debe usar ningún disolvente orgánico, ya que disolvería los elementos grasos que se pretende teñir; esto imposibilita el incluir las muestras en parafina, así que las muestras se suelen cortar por congelación, en un grosor de aproximadamente 30 m realizados con el criostato.

TÉCNICAS HISTOQUÍMICAS E INMUNOHISTOQUÍMICAS
Estos tipos de tinción no se basan en reacciones químicas básicas sino en reacciones más específicas tales como la actividad enzimática o inmunológica.
El tipo de reacciones que se aprovechan en estas técnicas son variadas.
Así podemos encontrar reacciones de alta especificidad entre moléculas como en el caso de la técnica de la lectina de tomate.

Técnica de la Lectina de tomate
Las lectinas son proteínas que se unen selectivamente a ciertos azúcares, así la lectina de tomate se combina con la N-acetilglucosamina, que en el hígado, por ejemplo, se encuentra en los macrófagos (células de Kupffer) y en las paredes endoteliales de los vasos (sinusoides).
En Histología se usa la lectina de tomate combinada con una molécula marcadora, (como la biotina). La biotina luego puede ser puesta de manifiesto en un proceso de revelado. El proceso es sencillo: se coloca la lectina marcada sobre el corte, se espera un tiempo suficiente para que la lectina se una al azúcar y luego se revela para que se vea al microscopio.
Esta técnica se puede realizar, tanto sobre cortes de alrededor de 30 m, realizados por congelación en el criostato, tanto en cortes de 5 a 10 m en parafina.

Las técnicas Histoquímicas (Histoenzimáticas) se basan en reacciones enzimáticas de moléculas (enzimas) presentes en los tejidos de la muestra.
La mecánica general se basa en colocar un sustrato adecuado al enzima a estudiar, sobre el corte histológico, para que se produzca la reacción enzimática y posteriormente detectar alguno de los productos de esa reacción.
Un ejemplo de este tipo de técnicas es la técnicas de la NDPasa.

Técnica de la NDPasa
La NDPasa es un enzima que se encuentra, entre otras en las células de microglía del Sistema Nervioso Central y en la pared de los vasos sanguíneos.
Para poner de manifiesto las estructuras que contienen este enzima en cortes histológicos, lo que se hace es colocar sobre el corte un producto que este enzima degrada, en este caso Inositol-fosfato. Se deja tiempo para que se produzca la reacción enzimática cuyo resultado es la formación de precipitado en el lugar donde la reacción se produce. Posteriormente se amplifica el marcaje mediante un tratamiento del precipitado con sulfuro y sales de plata, lo cual le proporciona un color pardo muy oscuro. Se hace un contraste con azul de toluidina para localizar las células no marcadas.
Las células marcadas (microglía) aparecen al microscopio de un color marrón oscuro, al igual que los vasos sanguíneos, mientras que el resto de tipos celulares quedan teñidos de azul claro.
Esta técnica se suele realizar sobre cortes de alrededor de 30 m, realizados por congelación en el criostato.

Las técnicas Inmuno-histoquímicas se basan en el fenómeno natural del reconocimiento específico de una molécula (antígeno) por parte de otra (anticuerpo), esto se conoce como reacción inmunitaria. Si usamos un anticuerpo marcado el resultado es que la marca se verá allí donde se encuentre el antígeno (dada la especificidad de la reacción antígeno-anticuerpo).
En la actualidad la bioindustria ofrece gran cantidad de anticuerpos marcados específicos contra una amplia variedad de antígenos.

Técnica de la GFAP
La GFAP es una proteína que se encuentra exclusivamente en los astrocitos y células de su mismo linaje.
En esta técnica inmuno-histoquímica lo que se hace es colocar sobre el corte una solución del anticuerpo marcado para que el anticuerpo localice y se una selectivamente a la GFAP. Posteriormente se revela, con lo que se consigue que solamente aparezcan coloreadas las células que contienen esa proteína, es este caso los astrocitos.
Esta técnica se suele realizar sobre cortes de alrededor de 30 m, realizados por congelación en el criostato.

TÉCNICAS ESPECÍFICAS PARA EL ESTUDIO DEL SISTEMA NERVIOSO
Las neuronas (junto con las células gliales), son las células propias del sistema nervioso, y como el estudiante conoce, tienen un cuerpo o soma celular del que parten, tanto dendritas como axón. Esta peculiaridad hace que el tejido nervioso presente una estructura especial en la que se entremezclan dendritas y axones (parénquima nervioso / neuropilo) y en el que se localizan los somas neuronales.
Esta característica peculiar junto con el interés que despierta el estudio del Sistema Nervioso ha provocado el desarrollo de numerosas técnicas de tinción propias de este tejido. En este apartado comentaremos algunas de las técnicas más utilizadas.

Técnica de Nissl
Esta técnica se utiliza habitualmente en el estudio del tejido nervioso en lugar de la Hematoxilina-Eosina. Es decir es una técnica topográfica, que nos muestra la distribución de los somas neuronales en el neuropilo.
El colorante utilizado en esta técnica es el Azul de toluidina, que se aplica después de un tratamiento previo en Dicromato potásico. En algunas variantes se utiliza como colorante el Violeta de Cresilo.
Los somas neuronales aparecen teñidos de azul oscuro mientras que el parénquima aparece casi blanco. Las células gliales (sus cuerpos celulares) se tiñen también de azul oscuro y se pueden llegar a distinguir los diferentes tipos por su forma y localización. En cortes los suficientemente finos (de hasta 5 ó 7 m de grosor), a grandes aumentos (400 - 1.000 x) se ven en el citoplasma del cuerpo neuronal (soma) unos acúmulos que se conocen como cuerpos de Nissl, los cuales corresponden a apilamientos de cisternas de retículo endoplasmático rugoso.
Esta técnica se suele realizar sobre cortes de entre 5 y 10 m, realizados en parafina.

Técnica de Klüver-Barrera
La técnica de Klüver-Barrera se utiliza apara el estudio topográfico del Sistema Nervioso de, tanto los somas neuronales, como de los paquetes de fibras (axones) mielínicos.
En esta técnica, además del Azul de Toluidina (para la tinción de los somas neuronales), se usa el Luxol fast blue, que tiñe selectivamente la mielina que rodea a ciertos axones (axones mielínicos).
Esta técnica se suele realizar sobre cortes de entre 5 y 10 m, realizados en parafina.

Técnica de la Plata reducida de Cajal
Esta técnica se utiliza, fundamentalmente para el estudio de paquetes de axones amielínicos (no mielinizados).
Esta técnica se basa en una impregnación argéntica del tejido nervioso y una posterior reducción química. Este proceso tiñe de marrón oscuro neurofilamentos y neurotúbulos, por lo que pone de manifiesto axones amielínicos (en los mielínicos el Nitrato de Plata no puede atravesar la vaina de mielina), dendritas y el cuerpo celular, no el núcleo (que no se tiñe).
Esta tinción se realiza en bloque, es decir se tiñe el cerebro completo (o una porción), y una vez teñido, el tejido se incluye en parafina, se corta (en un grosor de 10 m) y se monta en el portaobjetos.

Técnica de Golgi
La técnica de Golgi es, quizás, la más paradigmática de las técnicas de tinción empleadas en el estudio del Sistema Nervioso.
Esta técnica tiene como objetivo el poder estudiar neuronas completas, incluyendo soma, dendritas y axón. Como el estudiante conoce, las neuronas son células con prolongaciones (dendritas y axón) arborizadas que ocupan un gran volumen de tejido, un poliedro que incluya una neurona "tipo" puede tener 100-200 m x 100-200 m x 100-1000 m de aristas.
Esto implica varias circunstancias a tener en cuenta:
- En primer lugar resulta obvio que no se podrán observar neuronas completas en un corte de 5, 10 o 30 m de grosor, y será necesario realizar cortes más gruesos (100 - 150 m).
- En segundo lugar, solamente se deben teñir una pequeña proporción de neuronas, ya que si tiñeran todas, al teñir todos sus elementos, no se podrían distinguir unas neuronas de otras.
Ambas circunstancias se dan en la técnica de Golgi, en la que se impregna en bloque el tejido nervioso con una solución de Nitrato de Plata, después de una induración, con Dicromato potásico. Este proceso consigue impregnar una muy pequeña proporción de total de neuronas (aproximadamente el 0,03%). Hoy en día, aún es motivo de discusión el mecanismo por el cual unas neuronas se tiñen y otras no.
La técnica de Golgi se realiza en bloque, es decir con el cerebro completo (o una porción de este). Los cortes han de ser gruesos (100 - 150 m), por lo que la pieza no se incluye en parafina ni se corta con un microtomo rotatorio. La pieza impregnada con la técnica de Golgi se puede incluir en celoidina (un colodión purificado), o sencillamente encastrar en gelatina o incluso en parafina. Para cortar se suelen utilizar otros dispositivos menos sofisticados, tales como un vibrátomo, un microtomo de deslizamiento o incluso una sencilla cuchilla de barbero sobre un microtomo manual.
Como resultado de esta técnica, al microscopio so observan neuronas completas de las que se puede seguir el sinuoso recorrido de sus dendritas, usando el control del desplazamiento de la platina y el mando de enfoque. Como el Nitrato de Plata no puede atravesar la vaina de mielina, solamente se verán los axones no mielinizados.
También se pueden ver células gliales y vasos sanguíneos.

OTROS INSTRUMENTOS, PROTOCOLOS Y PROCEDIMIENTOS
Como se ha apuntado en los apartados anteriores, en Histología, además de los explicados, se usan otros instrumentos, protocolos y procedimientos, atendiendo a los resultados que se pretende obtener.
Así por ejemplo se usa una variedad de aparatos para cortar: 13 Técnicas histológicas: Tipos de microtomo

OTROS MICROTOMOS
Además del microtomo rotatorio o de Minot para el corte en parafina, que ya se ha explicado, en la práctica habitual en Histología para el desarrollo de técnicas específicas.

Ultramicrotomo
En esencia este instrumento sigue el modelo mecánico del microtomo rotatorio, pero con una considerablemente mayor precisión, para obtener cortes mucho más finos (40 - 50 nm) para ser usados en microscopía electrónica de transmisión.
En este microtomo se utilizan otro tipo de cuchillas de mayor dureza, hechas tanto de vidrio especialmente tratado como, incluso, con el filo de diamante.

Criostato
El criostato es, en esencia, un microtomo rotatorio en el interior de un arcón refrigerado. Obviamente se usa para cortar muestras a bajas temperaturas, para técnicas que requieren el mantenimiento de la actividad biológica en las muestras, por ejemplo, las técnicas histoenzimáticas y las inmunohistoquímicas.
Las muestras congelan, previo tratamiento con un crioprotector, y se cortan, montando los cortes sobre portaobjetos, sobre los que se suele hacer el tratamiento histoquímico o inmunohistoquímico.

Vibrátomo
El vibrátomo, como su nombre indica, se basa en un brazo vibrátil que realiza cortes no demasiado finos (entre 25 y 500 m). Se suele utilizar para técnicas histoenzimáticas e inmunohistoquímicas ya que no es necesario incluir en parafina las piezas, aunque en la actualidad se usa más el criostato para estas técnicas.
Ocasionalmente se ha utilizado el vibrátomo para realizar cortes con la técnica de Golgi.

Microtomo de mano
Es el más sencillo de los microtomos y simplemente es un tornillo sin fin que levanta la muestra sobre una superficie plana, sobre la que se desliza una afilada cuchilla de barbero para obtener los cortes.
SU rango de corte oscila entre los 20 a los 150 m y es muy utilizado en Histología vegetal. En histología animal se suele utilizar para obtener cortes gruesos en la técnica de Golgi.

ARTEFACTOS DE TINCIÓN
Como el estudiante ha podido comprobar la técnica es compleja y comprende muchos pasos, por lo que puede suceder que en alguno de estos pasos se produzca alguna distorsión o pequeño fallo, que luego se detecta durante el estudio de la muestra al microscopio, es lo que se conoce como artefactos de tinción. 14 Técnicas histológicas. Artefactos de tinción
En sí mismos los artefactos no tienen ningún valor histológico, pero al encontrárselos durante el estudio de las preparaciones el estudiante puede llegar a confundirlos con elementos propios del tejido lo que hace conveniente que el estudiante tenga conciencia de su existencia.
La mayoría de los artefactos producen alteraciones microscópicas que son totalmente invisibles a simple vista por lo que resulta muy difícil que el histólogo pueda evitarlos.
En las páginas siguientes el estudiante encontrará diferentes ejemplos de los artefactos más habituales que pueden encontrarse en el estudio de preparaciones histológicas.

BANDEADO
El aspecto bandeado que muestran algunas preparaciones se suele producir por un ángulo de incidencia de la cuchilla incorrecto.
En algunas otras ocasiones se produce un bandeado al intentar cortar demasiado fino un tejido que no tiene la dureza y/o consistencia suficiente.

BURBUJAS
Algunas preparaciones muestran pequeñas burbujas de aire atrapadas en el medio de montaje.
Este artefacto se suele dar cuando el medio de montaje es muy denso y solidifica de forma rápida.

INCLUSIONES Y MANCHAS DE COLOR
A veces, durante el proceso de preparación de muestras, preferentemente durante el montaje final, se “cuelan” sobre el corte motas de polvo, pequeños pelos y otros elementos del ambiente que se fijan en la preparación al utilizar el medio de montaje.
También estas inclusiones pueden ser precipitados de color debidos a pequeños cristales colorante.

MELLAS
Las mellas se producen por pequeñas imperfecciones del filo de la cuchilla a la hora de cortar en el microtomo.
Estas mellas provocan un arrastre y destrucción de una banda recta de tejido cuyo ancho coincide con la anchura de la imperfección del filo de la cuchilla y que ocupan todo el tejido en la dirección del corte.

PLIEGUES
Los pliegues se suelen producir durante el montaje del corte sobre el portaobjetos.
A veces se trata de una simple ondulación del tejido, a veces se trata de un gran pliegue que se dobla sobre sí mismo.


Tenemos el convencimiento que la lectura de este tema ayudará al estudiante a comprender el procesamiento histológico necesario para obtener los cortes que estudiará al microscopio y ello redundará en una mejor comprensión de las células tejidos y estructuras que observará durante el estudio.

Clase / Técnicas Histológicas

Artículo 2:Técnicas histológicas: Operativa del microscopio óptico

2/14 Valentin Martín
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